如何保證羅氏定量PCR儀的溫度控製的準確性？

溫度的準確性是指樣品孔溫度與(yu) 設定溫度的一致性，它直接關(guan) 係到實驗的成敗。如果排除樣品加入過程中的問題，對於(yu) PCR反應而言zui重要的莫過於(yu) 溫度控製的準確性，由於(yu) PCR是一個(ge) 幾何級數擴增的過程，擴增過程中退火溫度的細微變化會(hui) 被放大而直接影響結果，不論是變性、退火還是延伸都需要準確控製溫度，對退火溫度而言溫控顯的尤為(wei) 重要，有時1度甚至0.5度的差異也能決(jue) 定實驗的成功與(yu) 失敗，所謂差之毫厘，謬之千裏。因而對PCR擴增儀(yi) 而言溫度控製就意味著質量。

溫度的均勻性是指樣品孔間的溫度差異，它關(guan) 係到在不同樣品孔進行反應結果的一致性。我們(men) 在實驗中發現有時用同樣的樣品，同樣的PCR反應程序，zui後的結果竟然差異非常明顯，或許就是因為(wei) 不同位置的溫度不均一性所致。

溫度控製除了度，還有一個(ge) 廠家喜歡大力宣傳(chuan) 的指標——升降溫的速度。更快的升降溫速度，可以縮短反應進行的時間，而且縮短了可能的非特異性結合、反應的時間，能提高PCR反應煌特異性。因此從(cong) 本質而言溫控方式就從(cong) 以前相對穩定耐用的機械式轉向了升降溫更快速的半導體(ti) 。除了機械本身的原因，影響升降溫速度的還有製作承托樣品管的基座模塊的材料的導熱性。

現在的羅氏定量PCR儀(yi) 一般具有兩(liang) 種溫控模式，即模塊溫控模式（Block-control）和反應管溫控模式）（tube-control）。在模塊溫控模式下，機器根據探se器直接探se的溫控模塊（即承載樣品的金屬台）的溫度進行控製，這種模式適用於(yu) 長時間的靜態孵育（如連接、酶切、去磷酸化等）。反應管溫控模式實際上是一種模擬試管/PCR板的溫控模式，根據探se器所探測到的溫控模塊的溫度由計算機計算出管內(nei) /PCR板孔內(nei) 樣品液的溫度來進行控製。一般說來，試管溫控更為(wei) 準確，因為(wei) 管內(nei) 樣品的溫度無法與(yu) 溫控模塊同時達到預設溫度。特別是PCR反應中的孵育過程一般都很短暫（30秒或更短），如果采用隻有模塊溫控模式的話，反應混合物孵育的時間與(yu) 程序設定的時間會(hui) 有相當大的差距。而反應管控製的算法能自動補償(chang) 時間，而且適合各種類型的反應管，確保反應混俁(yu) 物按照程序設定的時間維持預設溫度。

有的羅氏定量PCR儀(yi) 廠家推出了另一種溫控方式；熱敏電極溫控模式。該方法將一個(ge) 熱敏電極插入一個(ge) 專(zhuan) 門的測量管中（管中裝有礦物油），反應進行時，將該測量管插入溫控模塊的樣品進行檢測。他們(men) 認為(wei) 通過此途徑可以監測反應管內(nei) 樣品的實際溫度，但這種方法未免有些華而不實；（1）測量管中礦物油的溫度變化與(yu) 實際反應樣品的溫度變化未必一致；（2）因為(wei) 測量管必須占用一個(ge) 樣品孔，所以使用該溫控方式時就無法使用96孔PCR板作實驗。