熒光定量pcr儀工作原理

將標記有熒光素的Taqman探針與(yu) 模板DNA混合後，完成高溫變性，低溫複性，適溫延伸的熱循環，並遵守聚合酶鏈反應規律，與(yu) 模板DNA互補配對的Taqman探針被切斷，熒光素遊離於(yu) 反應體(ti) 係中，在特定光激發下發出熒光，隨著循環次數的增加，被擴增的目的基因片段呈指數規律增長，通過實時檢測與(yu) 之對應的隨擴增而變化熒光信號強度，求得Ct值，同時利用數個(ge) 已知模板濃度的標準品作對照，即可得出待測標本目的基因的拷貝數。

　　Ct值（Cyclethreshold，循環閾值）的含義(yi) 為(wei) ：每個(ge) 反應管內(nei) 的熒光信號到達設定閾值時所經曆的循環數。

　　1. 熒光閾值（threshold）的設定

　　PCR反應的前15個(ge) 循環的熒光信號作為(wei) 熒光本底信號，熒光閾值的缺省（默認）設置是3-15個(ge) 循環的熒光信號的標準偏差的10倍，即：threshold= 10*SDcycle 3-15

　　2. Ct值與(yu) 起始模板的關(guan) 係

　　每個(ge) 模板的Ct值與(yu) 該模板的起始拷貝數的對數存在線性關(guan) 係，公式如下。

　　Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)

　　n為(wei) 擴增反應的循環次數，X0為(wei) 初始模板量，Ex為(wei) 擴增效率，N為(wei) 熒光擴增信號達到閾值強度時擴增產(chan) 物的量。

　　起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代Ct值。因此，隻要獲得未知樣品的Ct值，即可從(cong) 標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。