定量PCR儀引物長度設定

① 引物長度

一般引物長度為(wei) 18~30堿基。總的說來，決(jue) 定引物退火溫度（Tm值）重要的因素就是引物的長度。有以下公式可以用於(yu) 粗略計算引物的退火溫度。

在引物長度小於(yu) 20bp時：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃

在引物長度大於(yu) 20bp時：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃

另外有許多軟件也可以對退火溫度進行計算，其計算原理會(hui) 各有不同，因此有時計算出的數值可能會(hui) 有少量差距。為(wei) 了優(you) 化PCR反應，使用確保退火溫度不低於(yu) 54℃的短的引物可獲得好的效率和特異性。

總的說來，每增加一個(ge) 核苷酸引物特異性提高4倍，這樣，大多數應用的短引物長度為(wei) 18個(ge) 核苷酸。引物長度的上限並不很重要，主要與(yu) 反應效率有關(guan) 。由於(yu) 熵的原因，引物越長，它退火結合到靶DNA上形成供DNA聚合酶結合的穩定雙鏈模板的速率越小。

② GC含量

一般引物序列中G+C含量一般為(wei) 40%~60%，一對引物的GC含量和Tm值應該協調。若是引物存在嚴(yan) 重的GC傾(qing) 向或AT傾(qing) 向則可以在引物5’端加適量的A、T或G、C尾巴。

③ 退火溫度

退火溫度需要比解鏈溫度低5℃，如果引物堿基數較少，可以適當提高退火溫度，這樣可以使PCR的特異性增加；如果堿基數較多，那麽(me) 可以適當減低退火溫度，是DNA雙鏈結合。一對引物的退火溫度相差4℃～6℃不會(hui) 影響PCR的產(chan) 率，但是理想情況下一對引物的退火溫度是一樣的，可以在55℃～75℃間變化。 ④ 避免擴增模板的二級結構區域

選擇擴增片段時好避開模板的二級結構區域。用有關(guan) 計算機軟件可以預測估計目的片段的穩定二級結構，有助於(yu) 選擇模板。實驗表明，待擴區域自由能（△G）小於(yu) 58.6lkJ/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區域時，用7-deaza-2’-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。

⑤ 與(yu) 靶DNA的錯配

當被擴增的靶DNA序列較大的時候，一個(ge) 引物就有可能與(yu) 靶DNA的多個(ge) 地方結合，造成結果中有多個(ge) 條帶出現。這個(ge) 時候有必要先使用BLAST軟件進行檢測，