細胞培養實驗室的設置及設備

　　(一) 細胞培養(yang) 實驗室的設置

　　組織細胞培養(yang) 技術與(yu) 其他一般實驗室工作的主要區別在於(yu) 要求保持無菌操作，避免微生物及其他有害因素的影響.目前,超淨工作台的廣泛使用，很大程度上方便了組織細胞培養(yang) 工作，並使一些常規實驗室有可能用於(yu) 進行細胞培養(yang) .

　　細胞培養(yang) 實驗室應能進行六方麵的工作：無菌操作、孵育、製備、清洗、消毒滅菌處理、儲(chu) 藏。

　　1．無菌操作區

　　（1)無菌操作室：無菌操作區隻限於(yu) 細胞培養(yang) 及其他無菌操作的區域，最好能與(yu) 外界隔離,不能穿行或受其他幹擾。

　　理想的無菌操作室應劃為(wei) 三部分：

　　a）更衣室—―供更換衣服、鞋子及穿戴帽子和口罩。

　　b）緩衝(chong) 間—―位於(yu) 更衣間與(yu) 操作間之間，目的是為(wei) 了保證操作間的無菌環境,同時可放置恒溫培養(yang) 箱及某些必需的小型儀(yi) 器。

　　c)無菌操作間—―專(zhuan) 用於(yu) 無菌操作、細胞培養(yang) 。其大小要適當，且其頂部不宜過高(不超過2.5m）以保證紫外線的有效滅菌效果；牆壁光滑*以便清潔和消毒.工作台安置不應靠牆壁，台麵要光滑壓塑作表麵，漆成白色或灰色以利於(yu) 解剖組織及酚紅顯示pH的觀察。

　　無菌操作間的空氣消毒:

　　紫外線燈—－產(chan) 生臭氧，並且室內(nei) 溫度及濕度均較高，不利於(yu) 工作人員健康。

　　空氣過濾的恒溫恒濕裝置—－最好。

　　表1潔淨室（區）空氣潔淨度級別表

　　潔淨度級別塵粒最大允許數／立方米微生物最大允許數浮遊菌／立方米沉降菌／皿

　　100級3，500051

　　10000級350，0002，0001003

　　100000級3,500，00020,00050010

　　300000級10,350,00060,000-15

　　無臭氧紫外線消毒器

　　電子消毒滅菌器—－在高壓電場作用下，電子管的內(nei) 外電極發生強烈電子轟擊，使空氣電離而將空氣中的氧轉換成臭氧。臭氧是一種強氧化劑，能同細菌的胞膜及酶蛋白氫硫基進行氧化分解反應，從(cong) 而靠臭氧氣體(ti) 彌漫性擴散達到殺菌之目的，消毒時沒有死角。消毒後空間的殘留臭氧隻需30～40min即能自行還原成氧氣,空氣不留異味，消毒物體(ti) 表麵不留殘毒。

　　（2）淨化工作台：操作簡單，安裝方便，占用空間小且淨化效果很好。一般細菌培養(yang) 室使用的淨化工作台主要有兩(liang) 種：a）側(ce) 流式或稱垂直式b)外流式或稱水平層流式。

　　淨化工作台工作原理(大致相同）-－通常是將室內(nei) 空氣經粗過濾器初濾，由離心風機壓入靜壓箱，再經高效空氣過濾器精濾，由此送出的潔淨氣流以一定的均勻的斷麵風速通過無菌區，從(cong) 而形成無塵無菌的高潔淨度工作環境。

　　側(ce) 流式工作台—－空氣淨化後的氣流由左或右側(ce) 通過工作台麵流向對側(ce) ，也有從(cong) 上向下或從(cong) 下向上流向對側(ce) ，形成氣流屏障保持工作區無菌。工作台結構為(wei) 封閉式。

　　外流式(水平式)工作台—－淨化後的空氣麵向操作者流動，因而外方氣流不致混入操作，但進行有害物質實驗操作則對操作者不利。工作台結構為(wei) 開放式（已少用)。

　　淨化工作台應用注意：

　　(1）淨化工作台應安裝在隔離好的無菌間或清潔無塵的房間內(nei) ，以免塵土過多易使過濾器阻塞,降低淨化效果，縮短其使用壽命。

　　（2）新安裝的或長期未使用的工作台，工作前必須對工作台和周圍環境用真空吸塵器或不產(chan) 生纖維的工具進行清潔工作,然後再采用藥物滅菌法或紫外線滅菌進行滅菌處理。

　　（3）使用淨化工作台前，應先用75％酒精擦洗台麵，並提前以紫外線滅菌燈照射30~50min處理淨化工作區內(nei) 積存的微生物.關(guan) 閉滅菌燈後應啟動風機使之運轉兩(liang) 分鍾後再進行培養(yang) 操作。

　　（4）淨化工作區內(nei) 不應存放不必要的物品，以保持潔淨氣流流型不受幹擾。

　　(5）注意淨化區內(nei) 氣流的變化，一旦感到氣流變弱，如酒精燈火焰不動，加大電機電壓仍未見情況改變則說明濾器已被阻塞，應及時更換。一般情況下，高效過濾器三年更換一次。更換高過濾器應請專(zhuan) 業(ye) 人員操作，以保持密封良好。粗過濾器中的過濾布（無紡布）應定期清洗更換，時間應根據工作環境潔淨程度而定，通常間隔3—6個(ge) 月進行一次。

　　（6）淨化工作台使用完畢應及時清理工作台麵上的物品並用酒精擦洗台麵使之始終保持潔淨。

　　（7）淨化工作台應定期進行功能測試，檢查淨化工作台各項工作指標是否達到要求,例如進行無菌試驗，定期檢查台麵空氣的潔淨度是否達標.

　　超淨工作台的無菌程度檢查超淨工作台在消毒處理後，無菌試驗前及操作過程中需檢查空氣中菌落數；取直徑約90mm平皿，在超淨工作台內(nei) 點燃酒精燈，在酒精燈旁，以無菌操作，將平皿半開注入溶化的營養(yang) 瓊脂培養(yang) 基約20ml，製成平板，在30~35℃預培養(yang) 48小時，證明無菌後將平板3個(ge) ，以無菌方式帶入超淨工作台內(nei) 左、中、右各放一個(ge) ;打開平皿蓋扣置,平板在空氣中暴露30分鍾後將平皿蓋蓋好，置30～35℃培養(yang) 48小時，取出檢查，100級清潔度要求：3個(ge) 平皿上生長的菌落數平均不得超過1個(ge) .

　　超淨工作台應定期請有關(guan) 部門檢查其潔淨度，應達到100級（一般用塵埃粒子計數儀(yi) ）檢測塵埃粒徑≤5祄的粒數不得超過3。5個(ge) ／升；空氣流量應控製在0.75~1.0m3/s;細菌菌落數平均<1個(ge) ，可根據無菌狀況必要時置換過濾器。

　　2．孵育區

　　本區對無菌的要求雖不比無菌區嚴(yan) 格，但仍需清潔無塵，因此也應設置在幹擾少而非來往穿行的區域。孵育可在孵箱或可控製溫度的溫室中進行，後者費用高，一般實驗室多采用孵箱進行工作.

　　3．製備區

　　在該區主要進行培養(yang) 液及有關(guan) 培養(yang) 用的液體(ti) 等的製備。

　　4．儲(chu) 藏區

　　主要存放各類冰箱、幹燥箱、液氮罐、無菌培養(yang) 液、培養(yang) 瓶等，此環境也需要清潔無塵.

　　5．清洗和消毒滅菌區

　　清潔和消毒滅菌區應與(yu) 其他區域分開，主要進行所有細胞培養(yang) 器皿的清洗、準備、消毒及三蒸水製備等工作。

　　(二）細胞培養(yang) 實驗室的設備

　　組織細胞培養(yang) 室除一般實驗室的普通常規設備外，尚有一些特殊需要的設備。基本可分為(wei) 兩(liang) 大類：第一類為(wei) 常用的基本設備;第二類為(wei) 較高級的特殊設備.

　　1。常用的基本設備

　　（1)儀(yi) 器：

　　a）顯微鏡：倒置顯微鏡—-是組織細胞培養(yang) 室所必需的日常工作常規使用設備之一，便於(yu) 掌握細胞的生長情況並觀察有無汙染等。

　　——若有條件，尚可配置帶有照相係統的高質量相差顯微鏡、解剖顯微鏡、熒光顯微鏡、錄像係統或縮時電影拍攝裝置等，以便隨時觀察、記錄、攝影細胞生長情況。

　　a）培養(yang) 箱：體(ti) 外培養(yang) 的細胞和體(ti) 內(nei) 細胞一樣，需要在恒定的溫度下生存，大多數情況下，最適溫度是37℃,溫差變化一般不應超過±0。5℃，細胞在溫度升高2℃時，持續數小時即不能耐受，40℃以上將很快死亡.因此需要有能控製溫度的培養(yang) 箱，如具有較高靈敏度的恒溫培養(yang) 箱及CO2培養(yang) 箱。

　　恒溫培養(yang) 箱——應選隔水式或晶體(ti) 管自控溫培養(yang) 箱，此類培養(yang) 箱靈敏度高，溫度控製較穩定。一般的恒溫培養(yang) 箱價(jia) 格較便宜,其缺點是隻宜於(yu) 作密閉式培養(yang) 。

　　CO2培養(yang) 箱—-目前多數的細胞培養(yang) 室已廣泛使用。CO2培養(yang) 箱的優(you) 點是能夠提供進行細胞培養(yang) 時所需要的一定量的CO2（常用濃度為(wei) 5%)，易於(yu) 使培養(yang) 液的pH保持穩定,適用於(yu) 開放或半開放培養(yang) 。培養(yang) 細胞的器皿可用培養(yang) 皿、培養(yang) 板或培養(yang) 瓶；當使用培養(yang) 瓶時,可將瓶蓋略微旋鬆，使培養(yang) 瓶內(nei) 與(yu) 外界保持通氣狀態。由於(yu) 這種培養(yang) 方法培養(yang) 器皿內(nei) 部與(yu) 外界相通，培養(yang) 箱內(nei) 空氣必須保持清潔，應定期以紫外線照射或酒精消毒。同時培養(yang) 箱應放置盛有無菌蒸餾水的水槽，防止培養(yang) 液蒸發,使箱內(nei) 相對濕度始終保持為(wei) 100％。

　　c）幹燥箱：用於(yu) 細胞培養(yang) 箱的有些器械、器皿需要烘幹後才能使用,玻璃器皿等須幹熱消毒.幹熱消毒時，電熱幹燥箱升溫較高，一般需達到160℃以上。通常使用鼓風式電熱幹燥箱。其優(you) 點是溫度均勻、效果較好，缺點是升溫過程較慢。升溫時不能先升溫後鼓風而應鼓風與(yu) 升溫同時開始，至100℃時，停止鼓風，應避免包裹器皿的紙或棉花燒焦，燒焦的碎屑可影響細胞的生長。消毒後,不能立即打開箱門以免驟冷而導致玻璃器皿損壞，應等候溫度自然下降至100℃以下方可開門。

　　d）水純化裝置：細胞培養(yang) 對水的質量要求較高，細胞培養(yang) 以及與(yu) 細胞培養(yang) 工作相關(guan) 的液體(ti) 的配製用水必須事先嚴(yan) 格純化處理。水純化時可采用離子交換裝置或蒸餾器。離子交換純水尚不能有效去除有機物，因此用水時尚需再次蒸餾。進行細胞培養(yang) 時配製各種培養(yang) 液及試劑等均需使用三次蒸餾水:即使是用於(yu) 玻璃器皿的衝(chong) 洗，也應使用二次以上蒸餾水.

　　目前國內(nei) 使用較多的是自動雙重純水蒸餾器（石英管加熱）,使用方便，安全、蒸餾速度快（1600ml/h）。

　　使用注意：

　　○a不可采用普通自來水蒸餾，以免蒸餾器內(nei) 很快結成水垢影響蒸餾效果;同時,還需視蒸餾器內(nei) 存水垢程度定期*清洗蒸餾器.

　　○b正確的使用方法是將經金屬蒸餾器蒸餾的蒸餾水加入玻璃蒸餾器內(nei) 進行再次蒸餾。

　　一般配製培養(yang) 液的用水應在配液前蒸餾，不宜使用存放數日的三蒸水，以免影響培養(yang) 用水的質量.

　　目前市場上供應的是含有各種級別和類型的采用一種或多種純化方法相結合的使普通水純化為(wei) 純水和超純水的純水係統可供選擇。例如：設計靈活的可以掛壁、也可為(wei) 台式，也可以有儲(chu) 水箱、也可直接用分液槍的純水裝置；還可根據各類實驗用水需求選擇配備有效殺菌或去除DNA酶、RNA酶、蛋白酶等，甚至可有效去除掉熱源、內(nei) 毒素的超濾型純水器。

　　e）冰箱：細胞培養(yang) 室必須配備

　　○a普通冰箱或冷藏櫃

　　—-儲(chu) 存培養(yang) 液、生理鹽水、Hank’s液試劑等培養(yang) 用的物品及短期保存組織標本。

　　○b低溫冰箱（—20℃）、超低溫冰箱

　　—-用於(yu) 儲(chu) 存需要冷凍保存生物活性及較長時期存放的製劑,如酶、血清等。

　　——細胞培養(yang) 室的冰箱應屬專(zhuan) 用，不得存放易揮發、易燃燒等對細胞有害的物質，且應保持清潔。

　　f）細胞冷凍儲(chu) 存器：儲(chu) 存器常用的是液氮容器。根據使用需要分為(wei) 不同的類型及多種規格。選擇購置液氮容器時要綜合考慮容積大小,取放使用方便及液氮揮發量（經濟）三種因素.液氮容器的大小可自25L～500L，可以儲(chu) 存1ml的安瓿250～15000個(ge) 左右。液氮溫度可低達-196℃，使用時應防止凍傷(shang) 。由於(yu) 液氮不斷揮發，應注意觀察存留液氮情況，及時定期補充液氮，避免揮發過多而致細胞受損。

　　目前，國內(nei) 各類實驗室已廣泛使用新型的細胞冷凍儲(chu) 存器。市場所提供的各種新型的細胞冷凍儲(chu) 存器具有性能優(you) 異，使用方便等特點.例如：

　　——可通過*電子控製器實現凍存自動化並監測液氮水平和樣品溫度，確保樣品溫度始終處於(yu) 設定溫度點；

　　-—可配備*報警係統,分別警報液氮液麵、溫度、電池、電壓、電源等失常情況：

　　——同時具備熱氣體(ti) 旁路係統,防止高於(yu) -130℃的暖空氣進入液氮罐，從(cong) 而更有效地保護樣品,防止升溫.

　　另外,多種規格的*液氮運輸，供應罐係列不僅(jin) 移動方便,還可通過連接管給儲(chu) 存罐補充液氮，提高工作效率，保證樣品安全。

　　g）離心機：進行細胞培養(yang) 時，常規需要進行製備細胞懸液、調整細胞密度、洗滌、收集細胞等工作，通常需要使用離心機.

　　○a一般可常規配置4000rpm的國產(chan) 台式離心機，例如細胞沉降，使用80～100g的離心機即可，離心力過大有時可能引起細胞的損傷(shang) 。

　　○b另外，可根據需要添置其他類型如大容量或可調節溫度的離心機等

　　○c若需特殊用途,例如某些細胞的分離製備需梯度離心，則需另行配置實驗所需的具備其他特殊功能的離心機。

　　h）天平：常用的有扭力天平、精密天平及各種電子天平。

　　分析天平的感量為(wei) 0。1mg、0。01mg和0.001mg。根據稱取物質的量和稱量精度的要求，選擇適宜級別的天平。要求精密稱定時，當取樣量大於(yu) 100mg選用感量為(wei) 0.1mg天平，在100－10mg選用感量為(wei) 0.01mg天平，小於(yu) 10mg選用感量為(wei) 0。001mg天平。

　　i）消毒器:直接或間接與(yu) 細胞接觸的物品均需消毒滅菌處理。

　　常用:○a手提式高壓蒸汽消毒器

　　○b目前市場上，具有高效、安全、方便等性能,適用於(yu) 各種器皿、液體(ti) 、培養(yang) 基的高壓滅菌裝置已在流通（如脈動真空滅菌器）。可供使用者在滅菌的同時監測滅菌容器內(nei) 的壓力和溫度，確保滅菌質量和安全,並可通過記憶（儲(chu) 存)支持係統改變各種參數（例如滅菌、排氣、加熱等參數），即使在進行滅菌時發生停電故障，仍可保留所設定的參數

　　j）濾器:目前細胞培養(yang) 工作中采用的培養(yang) 用液，包括人工合成培養(yang) 液、血清、消化用胰酶等常含有維生素、蛋白、多肽、生長因子等物質，這些物質在高溫或射線照射下易發生變性或失去功能，因而上述液體(ti) 多采用濾過消毒以除去細菌。

　　目前常使用的濾器有Zeiss濾器、玻璃濾器和微孔濾器,各種濾器有其使用原理和特點（後詳述).

　　(2）培養(yang) 用器皿：

　　a）培養(yang) 器皿：供細胞接種、生長等用的器皿,可由透明度好、無毒的中性硬質玻璃或無毒而透明光滑的特製塑料製成。

　　（a）玻璃培養(yang) 器皿的優(you) 點是多數細胞均可生長，易於(yu) 清洗、消毒，可反複使用,並且透明而便於(yu) 觀察;缺點是易碎,清洗時費人力。

　　(b）塑料製培養(yang) 器皿的優(you) 點是一次性使用，廠家已消毒滅菌密封包裝，打開即可用於(yu) 細胞培養(yang) 操作。

　　常用的培養(yang) 器皿：

　　培養(yang) 瓶：由玻璃或塑料製成。主要用於(yu) 培養(yang) 、繁殖細胞。進行培養(yang) 時培養(yang) 瓶瓶口加蓋螺旋瓶蓋或膠塞，膠塞多用於(yu) 密封培養(yang) 。國產(chan) 培養(yang) 瓶的規格以容量（ml)表示，如250ml、100ml、25ml等；進口培養(yang) 瓶則多以底麵積(cm2）表示。

　　培養(yang) 皿:由玻璃或塑料製成，供盛取、分離、處理組織或做細胞毒性、集落形成、單細胞分離、同位素摻入、細胞繁殖等實驗使用.常用的培養(yang) 皿規格有10cm、9cm、6cm、3.5cm等.

　　多孔培養(yang) 板：為(wei) 塑料製品。可供細胞克隆及細胞毒性等各種檢測實驗使用。其優(you) 點是節約樣本及試劑，可同時測試大量樣本，易於(yu) 進行無菌操作。培養(yang) 板分為(wei) 各種規格，常用的規格有：96孔、24孔、12孔、6孔、4孔等。

　　各種單層生長的細胞在培養(yang) 器皿中長滿時可獲得的細胞數,主要是取決(jue) 於(yu) 器皿的底表麵積和細胞體(ti) 積的大小。常用培養(yang) 器皿及可獲得的細胞數（以Hela細胞為(wei) 例）見表2.

　　表2常用的培養(yang) 器皿及可獲得的細胞數

　　培養(yang) 器皿底麵(cm2）加培養(yang) 液量（ml)可獲細胞量

　　96孔培養(yang) 板0.320.11×105

　　24孔培養(yang) 板21。05×105

　　12孔培養(yang) 板4。52.01×106

　　6孔培養(yang) 板9.62。52。5×106

　　4孔培養(yang) 板285。07×106

　　3.5cm培養(yang) 皿83.02.0×106

　　6cm培養(yang) 皿215。05.2×106

　　9cm培養(yang) 皿4910.012.2×106

　　10cm培養(yang) 皿5510。013。7×106

　　25cm塑料培養(yang) 瓶255.05×106

　　75cm塑料培養(yang) 瓶7515～302×107

　　25ml玻璃培養(yang) 瓶194。03×106

　　100ml玻璃培養(yang) 瓶37.510。06×106

　　250ml玻璃培養(yang) 瓶7815。07×107

　　2500ml旋轉培養(yang) 瓶700100～2502。0×108

　　b）培養(yang) 操作有關(guan) 的器皿：

　　○a貯液瓶：主要用於(yu) 存放或配製各種培養(yang) 用液體(ti) 如培養(yang) 液、血清及試劑等。貯液瓶分為(wei) 各種不同規格，如1000ml、500ml、250ml、100ml、50ml、5ml等。

　　○b吸管：主要分為(wei) 刻度吸管、無刻度吸管。刻度吸管主要用於(yu) 吸取、轉移液體(ti) ，常用的有1ml、2ml、5ml、10ml等規格。無刻度吸管分為(wei) 直頭吸管及彎頭吸管，除可以作吸取、轉移液體(ti) 外，彎頭尖吸管還常用於(yu) 吹打、混勻及傳(chuan) 代細胞。

　　○c加樣器（移液器）：用於(yu) 吸取、移動液體(ti) 或滴加樣本。可根據需要調節量的大小，吸量準確、方便。尤以微量加樣器,可保證實驗樣品(或試劑）含量精確,重複性良好。目前，可高溫消毒的，多通道的各類移液器可供使用者選擇,能確保加樣準確、快速、方便並且達到無菌要求.

　　c）其他用品：尚有收集細胞用的離心管，放置試劑或臨(lin) 時插置吸管用的試管，裝放吸管以便消毒的玻璃或不鏽鋼容器,用於(yu) 存放小件培養(yang) 物品便於(yu) 高壓消毒的鋁製飯盒或貯槽,套於(yu) 吸管頂部的橡膠吸頭，封閉各種瓶、管的膠塞、蓋子、凍存細胞用的安瓿或凍存管、不同規格的注射器、燒杯和量筒以及漏鬥，超淨工作台使用的酒精燈，供實驗人員操作前清潔消毒手使用的盛有酒精或其他消毒液的微型噴壺等。

　　(3)器械:主要用於(yu) 解剖、取材、剪切組織及操作時持取物件。常用的有：手術刀或解剖刀、手術剪或解剖剪（彎剪及直剪），用於(yu) 解剖動物、分離及切剪組織,製備原代培養(yang) 的材料；眼科虹膜小剪(彎剪或直剪），用於(yu) 將組織材料剪成小塊;血管鉗及組織鑷、眼科鑷(彎、直），用於(yu) 持取無菌物品（如小蓋玻片）夾持組織等；口腔科探針或代用品,用以放置原代培養(yang) 之組織小塊。

　　2、特殊設備

　　細胞培養(yang) 實驗室除了應配備上述的常用基本設備以外，如有條件,可添置一些特殊或*設備儀(yi) 器,以便更有效、更精確、更深入地進行實驗室工作。例如：

　　（1）酶聯免疫檢測儀(yi) —-可用於(yu) 進行免疫學測定及細胞毒性、藥物敏感性檢測等。

　　（2）超低溫冰箱（-85℃）——便於(yu) 儲(chu) 存某些試劑及標本。

　　(3）旋轉培養(yang) 器——用於(yu) 某些特殊細胞或需要收獲大量細胞的培養(yang) 。

　　（4）熒光顯微鏡——進行熒光染色樣本的觀察。

　　（5）流式細胞儀(yi) -—可更精確及快速檢測細胞。

　　（6)用於(yu) 檢測細胞培養(yang) 條件的各種儀(yi) 器,例如專(zhuan) 門為(wei) 快速分析細胞培養(yang) 基中主要或關(guan) 鍵營養(yang) 成分、代謝產(chan) 物及氣體(ti) 含量設計的多功能細胞培養(yang) 分析儀(yi) 、手提式CO2濃度測定儀(yi) 等。