超微量分光光度計的常見的用途

　　分光光度計是一類很重要的分析儀(yi) 器,無論在物理學、化學、生物學、醫學、材料學、環境科學等科學研究領域,還是在化工、醫藥、環境檢測、冶金等現代生產(chan) 與(yu) 管理部門,紫外可見分光光度計督有廣泛而重要的應用。分光光度計就是利用分光光度法對物質進行定量定性分析的儀(yi) 器，常用於(yu) 核酸，蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。

　　超微量分光光度計已成為(wei) 現代分子生物實驗室常規儀(yi) 器。常用於(yu) 核酸，蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。核酸的定量是超微量分光光度計使用頻率最高的功能。可以定量溶於(yu) 緩衝(chong) 液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波長260nm。每種核酸的分子構成不一，因此其換算係數不同。定量不同類型的核酸，事先要選擇對應的係數。如：1OD的吸光值分別相當於(yu) 50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。測試後的吸光值經過上述係數的換算，從(cong) 而得出相應的樣品濃度。測試前，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液的體(ti) 積，爾後測試空白液和樣品液。然而，實驗並非一帆風順。讀數不穩定可能是實驗者最頭痛的問題。靈敏度越高的儀(yi) 器，表現出的吸光值漂移越大。

　　事實上，分光光度計的設計原理和工作原理，允許吸光值在一定範圍內(nei) 變化，即儀(yi) 器有一定的準確度和精確度。如德國伯赫Colibri超微量分光光度計的準確度≤1.0%（1A）。這樣多次測試的結果在均值1.0%左右之間變動，都是正常的。另外，還需考慮核酸本身物化性質和溶解核酸的緩衝(chong) 液的pH值，離子濃度等：在測試時，離子濃度太高，也會(hui) 導致讀數漂移，因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩衝(chong) 液，如TE，可大大穩定讀數。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由於(yu) 樣品中不可避免存在一些細小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在幹擾測試效果。為(wei) 了程度減少顆粒對測試結果的影響，要求核酸吸光值至少大於(yu) 0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。在此範圍內(nei) ，顆粒的幹擾相對較小，結果穩定。從(cong) 而意味著樣品的濃度不能過低，或者過高（超過光度計的測試範圍）。最後是操作因素，如混合要充分，否則吸光值太低，甚至出現負值；混合液不能存在氣泡，空白液無懸浮物，否則讀數漂移劇烈；必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品，否則濃度差異太大；換算係數和樣品濃度單位選擇一致；不能采用窗口磨損的比色杯；樣品的體(ti) 積必須達到比色杯要求的最小體(ti) 積等多個(ge) 操作事項。

　　除了核酸濃度，分光光度計同時顯示幾個(ge) 非常重要的比值表示樣品的純度，如A260/A280的比值，用於(yu) 評估樣品的純度，因為(wei) 蛋白的吸收峰是280nm。純淨的樣品，比值大於(yu) 1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低於(yu) 1.8或者2.0，表示存在蛋白質或者酚類物質的影響。A230表示樣品中存在一些汙染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純淨的核酸A260/A230的比值大於(yu) 2.0。A320檢測溶液的混濁度和其他幹擾因子。純樣品，A320一般是0。蛋白質通常是多種蛋白質的化合物，比色法測定的基礎是蛋白質構成成分：氨基酸（如酪氨酸，絲(si) 氨酸）與(yu) 外加的顯色基團或者染料反應，產(chan) 生有色物質。有色物質的濃度與(yu) 蛋白質反應的氨基酸數目直接相關(guan) ，從(cong) 而反應蛋白質濃度。

　　比色方法一般有BCA，Bradford，Lowry等幾種方法。

　　Lowry法：以最早期的Biuret反應為(wei) 基礎，並有所改進。蛋白質與(yu) Cu2反應，產(chan) 生藍色的反應物。但是與(yu) Biuret相比，Lowry法敏感性更高。缺點是需要順序加入幾種不同的反應試劑；反應需要的時間較長；容易受到非蛋白物質的影響；含EDTA，Tritonx-100，ammoniasulfate等物質的蛋白不適合此種方法。

　　BCA（Bicinchoninineacidassay）法：這是一種較新的、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在堿性溶液裏與(yu) Cu2反應產(chan) 生Cu，後者與(yu) BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波長。此化合物與(yu) 蛋白濃度的線性關(guan) 係，反應後形成的化合物非常穩定。相對於(yu) Lowry法，操作簡單，敏感度高。但是與(yu) Lowry法相似的是容易受到蛋白質之間以及去汙劑的幹擾。

　　Bradford法：這種方法的原理是蛋白質與(yu) 考馬斯亮蘭(lan) 結合反應，產(chan) 生的有色化合物吸收峰595nm。其最大的特點是，敏感度好，是Lowry和BCA兩(liang) 種測試方法的2倍；操作更簡單，速度更快；隻需要一種反應試劑；化合物可以穩定1小時，方便結果；而且與(yu) 一係列幹擾Lowry，BCA反應的還原劑（如DTT，巰基乙醇）相容。但是對於(yu) 去汙劑依然是敏感的。最主要的缺點是不同的標準品會(hui) 導致同一樣品的結果差異較大，無可比性。

　　某些初次接觸比色法測定的研究者可能為(wei) 各種比色法測出的結果並不一致，感到迷惑，究竟該相信哪種方法？由於(yu) 各種方法反應的基團以及顯色基團不一，所以同時使用幾種方法對同一樣品得出的樣品濃度無可比性。例如：Keller等測試人奶中的蛋白，結果Lowry，BCA測出的濃度明顯高於(yu) Bradford，差異顯著。即使是測定同一樣品，同一種比色法選擇的標準樣品不一致，測試後的濃度也不一致。如用Lowry測試細胞勻漿中的蛋白質，以BSA作標準品，濃度1.34mg/ml，以a球蛋白作標準品，濃度2.64mg/ml。因此，在選擇比色法之前，最好是參照要測試的樣本的化學構成，尋找化學構成類似的標準蛋白作標準品。另外，比色法定量蛋白質，經常出現的問題是樣品的吸光值太低，導致測出的樣品濃度與(yu) 實際的濃度差距較大。關(guan) 鍵問題是，反應後1011分光光度計的重要配件——比色杯的顏色是有一定的半衰期，所以每種比色法都列出了反應測試時間，所有的樣品（包括標準樣品），都必須在此時間內(nei) 測試。時間過長，得到的吸光值變小，換算的濃度值降低。除此，反應溫度、溶液PH值等都是影響實驗的重要原因。此外，非常重要的是，最好是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材質的比色杯，因為(wei) 反應後的顏色會(hui) 讓石英或者玻璃著色，導致樣品吸光值不準確。實驗室確定細菌生長密度和生長期，多根據經驗和目測推斷細菌的生長密度。在遇到要求較高的實驗，需要采用分光光度計準確測定細菌細胞密度。OD600是追蹤液體(ti) 培養(yang) 物中微生物生長的標準方法。以未加菌液的培養(yang) 液作為(wei) 空白液，之後定量培養(yang) 後的含菌培養(yang) 液。為(wei) 了保證正確操作，必須針對每種微生物和每台儀(yi) 器用顯微鏡進行細胞計數，做出校正曲線。實驗中偶爾會(hui) 出現菌液的OD值出現負值，原因是采用了顯色的培養(yang) 基，即細菌培養(yang) 一段時間後，與(yu) 培養(yang) 基反應，發生變色反應。另外，需注意的是，測試的樣品不能離心，保持細菌懸浮狀態。