流式細胞儀(yi) 可同時進行多參數測量,信息主要來自特異性熒光信號及非熒光散射信號。測量是在測量區進行的,所謂測量區就是照射激光束和噴出噴孔的液流束垂直相交點。液流中央的單個(ge) 細胞通過測量區時,受到激光照射會(hui) 向立體(ti) 角為(wei) 2π的整個(ge) 空間散射光線,散射光的波長和入射光的波長相同。散射光的強度及其空間分布與(yu) 細胞的大小、形態、質膜和細胞內(nei) 部結構密切相關(guan) ,因為(wei) 這些生物學參數又和細胞對光線的反射、折射等光學特性有關(guan) 。未遭受任何損壞的細胞對光線都具有特征性的散射,因此可利用不同的散射光信號對不經染色活細胞進行分析和分選。經過固定的和染色處理的細胞由於(yu) 光學性質的改變,其散射光信號當然不同於(yu) 活細胞。散射光不僅(jin) 與(yu) 作為(wei) 散射中心的細胞的參數相關(guan) ,還跟散射角、及收集散射光線的立體(ti) 角等非生物因素有關(guan) 。在流式細胞術測量中,常用的是兩(liang) 種散射方向的散射光測量:
①前向角(即0角)散射(FSC);
②側(ce) 向散射(SSC),又稱90角散射。這時所說的角度指的是激光束照射方向與(yu) 收集散射光信號的光電倍增管軸向方向之間大致所成的角度。一般說來,前向角散射光的強度與(yu) 細胞的大小有關(guan) ,對同種細胞群體(ti) 隨著細胞截麵積的增大而增大;對球形活細胞經實驗表明在小立體(ti) 角範圍內(nei) 基本上和截麵積大小成線性關(guan) 係;對於(yu) 形狀複雜具有取向性的細胞則可能差異很大,尤其需要注意。側(ce) 向散射光的測量主要用來獲取有關(guan) 細胞內(nei) 部精細結構的顆粒性質的有關(guan) 信息。側(ce) 向散射光雖然也與(yu) 細胞的形狀和大小有關(guan) ,但它對細胞膜、胞質、核膜的折射率更為(wei) 敏感,也能對細胞質內(nei) 較大顆粒給出靈敏反映。熒光信號主要包括兩(liang) 部分:
①自發熒光,即不經熒光染色,細胞內(nei) 部的熒光分子經光照射後所發出的熒光;
②特征熒光,即由細胞經染色結合上的熒光染料受光照而發出的熒光,其熒光強度較弱,波長也與(yu) 照射激光不同。自發熒光信號為(wei) 噪聲信號,在多數情況下會(hui) 幹擾對特異熒光信號的分辨和測量。在免疫細胞化學等測量中,對於(yu) 結合水平不高的熒光抗體(ti) 來說,如何提高信噪比是個(ge) 關(guan) 鍵。一般說來,細胞成分中能夠產(chan) 生的自發熒光的分子(例核黃素、細胞色素等)的含量越高,自發熒光越強;培養(yang) 細胞中死細胞/活細胞比例越高,自發熒光越強;細胞樣品中所含亮細胞的比例越高,自發熒光越強。