聚合酶鏈式反應（PCR）是一種用於(yu) 放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體(ti) 外的特殊DNA複製，PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加。目前，PCR成為(wei) 分子生物學研究的一部分。實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）技術，是指在PCR反應體(ti) 係中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個(ge) PCR進程，最後通過標準曲線對模板進行定量分析的方法。該項技術可以對DNA、RNA樣品進行相對定量、絕對定量和定性分析，提高了普通PCR技術的特異性和準確性，被廣泛應用於(yu) 基礎研究、疾病診斷、農(nong) 業(ye) 檢測和法醫調查等領域。
一、常規PCR
利用DNA分子會(hui) 在體(ti) 外95°高溫時會(hui) 發生變性解旋變成單鏈，然後降溫到60°C左右時引物會(hui) 與(yu) 單鏈DNA按堿基互補配對原則結合，接著再升高溫度到72°C左右，即DNA聚合酶最適反應溫度，DNA聚合酶會(hui) 沿著磷酸到五碳糖（5'-3'）的方向合成相應的互補鏈，如此循環往複以達到DNA分子擴增的目的，常規PCR技術無法實現精確定量。
二、實時熒光定量PCR
如要對DNA、RNA樣品進行精確定量研究，就需要采用實時熒光定量PCR，根據檢測實時熒光PCR產(chan) 物的方式不同，實時熒光定量PCR主要有DNA結合染料法、基於(yu) 探針的化學法、淬滅染料引物法等類型。
1.DNA結合染料法
原理：應用一種帶有熒光的、非特異的DNA結合染料檢測PCR過程中積累的擴增產(chan) 物。
應用於(yu) 核算定量和基因表達驗證。
優(you) 缺點：它們(men) 的優(you) 點是可以對任何雙鏈DNA進行定量，不需要探針，具有相對高的靈敏度和可靠性，並且成本低，簡單易用，缺點是它們(men) 能在反應中結合所有的DNA雙鏈，其中包括在PCR過程中產(chan) 生的引物二聚體(ti) 或其他非特異產(chan) 物。
染料法一般使用的是SYBR Green I染料，這是一種可以與(yu) 雙鏈DNA小溝結合的熒光染料，不會(hui) 與(yu) 單鏈DNA結合，並且在遊離狀態下幾乎無熒光，隻有與(yu) 雙鏈DNA結合才會(hui) 發出熒光，因此將PCR擴增產(chan) 生的雙鏈DNA數量與(yu) 熒光強度直接關(guan) 聯，產(chan) 生實時監測的效果。
2.基於(yu) 探針的化學法
原理：應用一個(ge) 或多個(ge) 熒光標記的寡核苷酸探針檢測PCR擴增產(chan) 物；依賴熒光能量共振傳(chuan) 遞檢測特異性擴增產(chan) 物。
應用於(yu) 核酸定量、基因表達驗證、等位基因鑒別、SNP分型、病原體(ti) 和病毒檢測、多重PCR。
優(you) 缺點：探針法的鑒別能力遠遠大於(yu) DNA結合染料法，因為(wei) 它們(men) 隻與(yu) 目的產(chan) 物結合，從(cong) 不與(yu) 引物二聚體(ti) 或其他非特異產(chan) 物結合，缺點是它的合成價(jia) 格高。
探針法中常用的TaqMan探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團連接在探針的5’末端，而淬滅基團則在3’末端，PCR擴增時在加入引物的同時加入探針，探針完整時，熒光信號被淬滅基團吸收，PCR擴增時，5’→3’外切酶活性將探針酶切降解，使熒光基團和淬滅基團分離，從(cong) 而檢測器可以接收到熒光信號。
3.淬滅染料引物法
原理：采用熒光標記引物擴增，從(cong) 而使熒光標記基團直接摻入PCR擴增產(chan) 物中，依賴熒光能量共振傳(chuan) 遞。
應用於(yu) 核酸定量、基因表達驗證、等位基因鑒別、SNP分型、病原體(ti) 和病毒檢測、多重PCR
優(you) 缺點：探針和目標片段的特異性結合產(chan) 生熒光信號，因此減少了背景熒光和假陽性，還可進行多重PCR擴增，缺點是原料成本價(jia) 格高
三、實時熒光PCR儀(yi)
實時熒光PCR係統包括熱循環儀(yi) ，用於(yu) 熒光激發的光學係統以及用於(yu) 收集熒光數據和管理分析的計算機軟件，數據通過實時分析軟件以圖表的形式顯示。
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