實時熒光定量PCR的使用步驟

實時熒光定量PCR的使用步驟

1 樣品RNA的抽提

①取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鍾使其*溶解。

②兩(liang) 相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體(ti) 15秒後，15到30℃孵育2到3分鍾。4℃下12000rpm離心15分鍾。離心後混合液體(ti) 將分為(wei) 下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配於(yu) 水相中。水相上層的體(ti) 積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。

③RNA沉澱 將水相上層轉移到一幹淨無RNA酶的離心管中。加等體(ti) 積異丙醇混合以沉澱其中的RNA，混勻後15到30℃孵育10分鍾後，於(yu) 4℃下12000rpm 離心10分鍾。此時離心前不可見的RNA沉澱將在管底部和側(ce) 壁上形成膠狀沉澱塊。

④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配製），清洗RNA沉澱。混勻後，4℃下7000rpm離心5分鍾。

⑤RNA幹燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉澱在室溫空氣中幹燥5-10分鍾。

⑥溶解RNA沉澱 溶解RNA時，先加入無RNA酶的水40μl用槍反複吹打幾次，使其*溶解，獲得的RNA溶液保存於(yu) -80℃待用。

2 RNA質量檢測

1）紫外吸收法測定

先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調零。然後取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）後，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液 濃度和純度。

① 濃度測定

A260下讀值為(wei) 1表示40 ?g RNA/ml。樣品RNA濃度(?g/ml)計算公式為(wei) ：A260 ×稀釋倍數× 40 ?g/ml。具體(ti) 計算如下：

RNA溶於(yu) 40 ?l DEPC水中，取5ul，1:100稀釋至495?l的TE中，測得A260 = 0.21

RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 ?g/ml = 840 ?g/ml 或 0.84 ?g/?l

取5ul用來測量以後，剩餘(yu) 樣品RNA為(wei) 35 ?l，剩餘(yu) RNA總量為(wei) ：

35 ?l × 0.84 ?g/?l = 29.4 ?g

②純度檢測

RNA溶液的A260/A280的比值即為(wei) RNA純度，比值範圍1.8到2.1。

2）變性瓊脂糖凝膠電泳測定

①製膠

1g瓊脂糖溶於(yu) 72ml水中，冷卻至60℃，10 ml的10× MOPS電泳緩衝(chong) 液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。

10×MOPS電泳緩衝(chong) 液

濃度  成分

0.4M  MOPS，pH 7.0

0.1M  乙酸鈉

0.01M  EDTA

灌製凝膠板，預留加樣孔至少可以加入25 ?l溶液。膠凝後取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內(nei) ，加足量的1×MOPS電泳緩衝(chong) 液至覆蓋膠麵幾個(ge) 毫米。

②準備RNA樣品

取3?gRNA，加3倍體(ti) 積的甲醛上樣染液，加EB於(yu) 甲醛上樣染液中至終濃度為(wei) 10?g/ml。加熱至70℃孵育15分鍾使樣品變性。

③電泳

上樣前凝膠須預電泳5min，隨後將樣品加入上樣孔。5-6V/cm電壓下2h，電泳至溴酚蘭(lan) 指示劑進膠至少2-3cm。

④紫外透射光下觀察並拍照

28S和18S核糖體(ti) RNA的帶非常亮而濃（其大小決(jue) 定於(yu) 用於(yu) 抽提RNA的物種類型），上麵一條帶的密度大約是下麵一條帶的2倍。還有可能觀察到一個(ge) 更小稍微擴散的帶，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體(ti) RNA）組成。在18S和28S核糖體(ti) 帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA製備過程中如果出現DNA汙染，將會(hui) 在28S核糖體(ti) RNA帶的上麵出現，即更高分子量的彌散遷移物質或者帶，RNA的降解表現為(wei) 核糖體(ti) RNA帶的彌散。用數碼照相機拍下電泳結果。

3 樣品cDNA合成

①反應體(ti) 係

序號  反應物  劑量

1  逆轉錄buffer  2μl

2  上遊引物  0.2μl

3  下遊引物  0.2μl

4  dNTP  0.1μl

5  逆轉錄酶MMLV  0.5μl

6  DEPC水  5μl

7  RNA模版  2μl

8  總體(ti) 積  10μl

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

②混合液在加入逆轉錄酶MMLV 之前先70℃幹浴3分鍾，取出後立即冰水浴至管內(nei) 外溫度一致，然後加逆轉錄酶0.5μl，37℃水浴60分鍾。

③取出後立即95℃幹浴3分鍾，得到逆轉錄終溶液即為(wei) cDNA溶液，保存於(yu) -80℃待用。