用流式細胞儀檢測細胞凋亡

       細胞凋亡的檢測方法眾(zhong) 多，流式細胞儀(yi) 檢測凋亡，是常用的方法。由於(yu) 流式細胞儀(yi) 固有的特點――可以準確的進行凋亡細胞的計數。因此，具有其它方法*的*性。下麵我們(men) 就簡單明了地介紹流式在檢測凋亡方麵的應用。
在凋亡誘導劑的作用下，首先是細胞色素C和apa f-1形成複合體(ti) ，線粒體(ti) 的功能發生衰退;後是caspase家族激活，磷脂酰絲(si) 氨酸外翻，這時細胞的形態已經發生了改變，可以看到細胞變小，胞核皺縮;zui後是細胞內(nei) DNA斷裂，形成凋亡小體(ti) 。
在凋亡發生的各個(ge) 過程當中，都有相應的流式細胞儀(yi) 的檢測方法，可以采用以下檢測方法：
1、線粒體(ti) 功能
2、DNA Cycle
3、Caspases
4、Annexin V Assay
5、DNA Fragmentation Assays
基本上涵蓋了細胞凋亡的各個(ge) 期，對各種檢測方法的原理和特點做一個(ge) 簡單介紹。
線粒體(ti) 功能檢測的試劑盒有深圳達科為(wei) 公司代理的試劑盒(產(chan) 品編號為(wei) BVK250)和BD公司出售的盒Apo-Alert試劑盒。其檢測主要采用陽離子型熒光染料。原理是：正常細胞中，染料可以在線粒體(ti) 內(nei) 聚集，發出明亮的紅色熒光;而細胞凋亡後，其線粒體(ti) 膜電位發生改變，染料無法進入線粒體(ti) ，隻能在胞質中以單體(ti) 形式存在，發出綠色的熒光。可以在熒光顯微鏡下，或流式檢測。采用488nm激發，其檢測波長分別是527nm和590nm。整個(ge) 實驗過程操作簡單，隻需要30min就可以見到結果。
Caspase家族可以檢測的分子非常多，也有不少商業(ye) 的試劑盒可以應用。即使沒有相應的試劑盒，隻要有相應抗體(ti) 基本上是可以檢測的，具體(ti) 的方法是參照細胞內(nei) 蛋白檢測的步驟。
在細胞凋亡過程中伴隨著一係列的形態特征改變，細胞膜的改變是這些特征中較早出現的一種。在凋亡細胞中，細胞膜磷脂酰絲(si) 氨酸(PS)從(cong) 細胞膜的內(nei) 側(ce) 翻轉到細胞膜的外側(ce) 。Annexin-V是一種35-36 KD的鈣粒子依賴的磷脂結合蛋白，它對PS具有較高的親(qin) 和力。細胞凋亡時，可以和外翻的PS結合，從(cong) 而可以檢測凋亡的細胞。發生死亡的細胞其細胞膜上的PS也外翻，因而也會(hui) 陽性。因此，常用的凋亡試劑盒除了采用Annexin-V標記之外，還會(hui) 加一種DNA染料，常用的有PI和7-AAD，由於(yu) 死亡的細胞膜通透性增高，染料可以進入細胞內(nei) 和DNA結合，從(cong) 而可以發熒光，區分出死細胞。
下圖給出的是在使用FAS單抗誘導前後的檢測結果，橫坐標是Annexin-V FITC, 縱坐標是PI，左上、右上、左下、右下四個(ge) 象限中右上象限代表死亡的細胞，左下象限是存活的細胞，右下象限是凋亡的細胞。
在采用Annixin V方法檢測凋亡細胞時，要特別強調一點：該方法適用於(yu) 懸浮生長的細胞，如：淋巴細胞等細胞的檢測。對於(yu) 貼壁生長的細胞，由於(yu) 在胰酶等消化處理過程中會(hui) 造成細胞膜的損傷(shang) ，會(hui) 造成較高的假陽性，從(cong) 而影響檢測結果。盡管目前，包括國外也有一些單位采用該方法檢測貼壁生長的細胞。我不推薦用該方法檢測。因為(wei) 其重複性較差，且需要操作時非常小心。
DNA周期檢測原本是用來反應細胞各個(ge) 期，即細胞增殖狀況的。利用細胞內(nei) DNA能夠和熒光染料，如PI結合的特性。細胞各個(ge) 時期由於(yu) 其DNA含量不同從(cong) 而結合的熒光染料不同，流式檢測的熒光輕度也不一樣。G2-M期DNA含量是G0-G1的兩(liang) 倍，而S期介於(yu) 兩(liang) 者之間。
但是由於(yu) 發現凋亡的細胞DNA含量較少，因而可以在細胞G0-G1期前麵有一個(ge) 亞(ya) 二倍體(ti) 峰，從(cong) 而認為(wei) 是凋亡細胞。但是由於(yu) 死亡的細胞本身其DNA含量也是減少的，因而非常難於(yu) 區分凋亡和死亡的細胞。在90年代，該方法曾經風靡一時，現在看來，那時的實驗結果需要推敲。盡管，經典的流式檢測資料給出的圖是認為(wei) 凋亡的細胞是緊挨著G0-G1期峰的一個(ge) 峰，死亡的細胞峰離G0-G1期峰較遠，但是這種典型的結果似乎很難獲得。有其它的替代方法，*可以不用這種方法。
晚期凋亡的細胞由於(yu) DNA的斷裂，因而可以出現DNA ladder，從(cong) 而也就有了經典的檢測方法TUNEl。流式也能進行Tunel檢測，其檢測原理與(yu) 經典Tunel原理基本一致。以BD公司的為(wei) 例，其利用TdT能將熒光素標記的dUTP標記到斷裂的DNA末端，從(cong) 而使凋亡的細胞具有熒光。但是由於(yu) 在細胞內(nei) 標記，細胞需要進行固定處理，操作類似免疫組織化學法，容易造成假陽性。建議采用原裝大廠的試劑盒，並且嚴(yan) 格的設立對照。經過預實驗方法穩定後再進行大規模實驗。標本處理後，均可以用熒光纖維鏡進行觀察，拍照。流式檢測後，可以進行的計算凋亡百分比。這一點，經典TUNEl是做不到的。