熒光定量PCR儀原理

熒光定量PCR儀(yi) 技術原理

將標記有熒光素的Taqman探針與(yu) 模板DNA混合後，完成高溫變性，低溫複性，適溫延伸的熱循環，並遵守聚合酶鏈反應規律，與(yu) 模板DNA互補配對的Taqman探針被切斷，熒光素遊離於(yu) 反應體(ti) 係中，在特定光激發下發出熒光，隨著循環次數的增加，被擴增的目的基因片段呈指數規律增長，通過實時檢測與(yu) 之對應的隨擴增而變化熒光信號強度，求得Ct值，同時利用數個(ge) 已知模板濃度的標準品作對照，即可得出待測標本目的基因的拷貝數。

Ct 值

Ct值（Cycle threshold，循環閾值）的含義(yi) 為(wei) ：每個(ge) 反應管內(nei) 的熒光信號到達設定閾值時所經曆的循環數

（如圖1所示）。

1. 熒光閾值（threshold）的設定

PCR反應的前15個(ge) 循環的熒光信號作為(wei) 熒光本底信號，熒光閾值的缺省（默認）設置是3-15個(ge) 循環的熒光信號的標準偏差的10倍，即：threshold = 10*SDcycle 3-15

2. Ct值與(yu) 起始模板的關(guan) 係

每個(ge) 模板的Ct值與(yu) 該模板的起始拷貝數的對數存在線性關(guan) 係，公式如下。

Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)

n為(wei) 擴增反應的循環次數，X0為(wei) 初始模板量，Ex為(wei) 擴增效率，N為(wei) 熒光擴增信號達到閾值強度時擴增產(chan) 物的量。

起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代Ct值。因此，隻要獲得未知樣品的Ct值，即可從(cong) 標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。

熒光化學物質

實時熒光定量PCR所使用的熒光物質可分為(wei) 兩(liang) 種：熒光探針和熒光染料。現將其原理簡述如下：

1. TaqMan熒光探針：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個(ge) 特異性的熒光探針，該探針為(wei) 一寡核苷酸，兩(liang) 端分別標記一個(ge) 報告熒光基團和一個(ge) 淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從(cong) 而熒光監測係統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個(ge) 熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與(yu) PCR產(chan) 物形成*同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術既可進行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為(wei) 基因診斷和個(ge) 體(ti) 化用藥分析的技術平台。

2. SYBR熒光染料：在PCR反應體(ti) 係中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地摻入DNA雙鏈後，發射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(hui) 發射任何熒光信號，從(cong) 而保證熒光信號的增加與(yu) PCR產(chan) 物的增加*同步。SYBR僅(jin) 與(yu) 雙鏈DNA進行結合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應是否特異。

3. 分子信標：是一種在5和3末端自身形成一個(ge) 8個(ge) 堿基左右的發夾結構的莖環雙標記寡核苷酸探針，兩(liang) 端的核酸序列互補配對，導致熒光基團與(yu) 淬滅基團緊緊靠近，不會(hui) 產(chan) 生熒光。PCR產(chan) 物生成後，退火過程中，分子信標中間部分與(yu) 特定DNA序列配對，熒光基因與(yu) 淬滅基因分離產(chan) 生熒光[2]  。