熒光定量PCR儀的兩個選購誤區

    誤區一：儀(yi) 器通道越多越好隨著PCR技術的成熟運用，多重擴增越來越熱鬧，熒光定量PCR儀(yi) 也不能幸免。從(cong) zui初ABI公司推出的單通道熒光定量PCR儀(yi) 發展到如今各個(ge) 廠家都推出4通道、5通道甚至6通道熒光定量PCR儀(yi) ，眼花繚亂(luan) 的選擇讓人無所適從(cong) ，就有人一不小心走進了“通道越多越好”的誤區。在使用有些廠家5通道的熒光定量儀(yi) 時，為(wei) 了確保實驗結果的性和準確性都要在實驗中使用ROX(一種熒光染料)或的Reference dye ，這些熒光染料都必須單獨使用一個(ge) 檢測通道。這樣以來，真正能檢測多重PCR熒光信號的有效通道隻有4個(ge) ，而且使用校正染料可能會(hui) 增加後期的使用成本。有的熒光定量PCR的檢測通道是隻為(wei) 自已廠家的的熒光染料或試劑開放的，有效檢測通道也絕非像宣傳(chuan) 資料中宣稱的那麽(me) 多。在購買(mai) 前確認熒光定量PCR儀(yi) 器的有效檢測通道尤為(wei) 重要，不能單單隻聽宣傳(chuan) 。考慮多重熒光定量PCR的通道數的時候也應該從(cong) 實驗室實際情況出發，多重PCR並非人人適用、人人可用，因為(wei) 它使實驗複雜化了。

　　誤區二：real-time PCR儀(yi) 無需梯度功能對於(yu) 使用染料法的定量PCR反應，雖然有各種各樣的PCR引物設計軟件或者經驗公式計算熔解溫度(Tm值)，但運用的公式不同、引物序列不同，Tm值的差異會(hui) 很大。引物的熔解溫度決(jue) 定了退火溫度。而且模版中堿基的組合千變萬(wan) 化，對於(yu) 特殊片斷，經驗公式得到的數據不一定能得出準確的結果，退火溫度細微的差異對結果都可能產(chan) 生決(jue) 定性的影響，因而“摸條件”一度是讓人很頭疼的問題。梯度PCR的出現部分解決(jue) 了一些問題——在反應過程中每個(ge) 孔的溫度控製條件可以在範圍內(nei) 按照梯度變化，根據結果，一步就可以摸索出的反應條件。不單退火溫度，連變性溫度和延伸溫度都可以優(you) 化——對於(yu) 多種聚合酶混合酶擴增如Invitrogen、Clontech、Promega的多數高保真Taq酶來說這個(ge) 非常重要，因為(wei) Taq和校正酶的*反應溫度可能有顯著差異，優(you) 化延伸溫度就顯得很重要。